افرادي که مسلط به آناليز ديتاهای (Next-Generation Sequencing (NGS هستند مي‌توانند در آزمايشگاه‌هاي ژنتيک، کارخانه‌هاي داروسازي و مراکز تحقيقاتي فعاليت کنند. همچنين شرکت‌هايي هم به دنبال پژوهشگر در حوزه نرم افزارهاي کاربردي براي تجزيه و تحليل داده‌هايNGS هستند تا بتوانند با تيم‌هاي سفارشي سازي نرم افزار بيوانفورماتيک براي داروسازي، بيوتکنولوژي و موسسات دانشگاهي در خارج از کشور همکاري کنند. اين موقعيت‌هاي شغلي نياز به دانش عميقي از آناليز دادهNGS و مسيرهاي بيولوژيکي و تجربه کار در پروژه‌هاي بيوانفورماتيکي دارد. از آنجا که بيوانفورماتيک پزشکي، يکي از گرايش‌هاي مقطع کارشناسي ارشد رشته مهندسي پزشکي است، در گفتگوي پيش رو، آقاي مهندس مهدي شاه حسيني تجربيات دو ساله خود در حوزه آناليز ديتاهايNGS را با افراد جوياي کار در رشته مهندسي پزشکي در ميان گذاشته‌اند.
لطفا خود را براي خوانندگان ماهنامه مهندسي پزشکي و تجهيزات آزمايشگاهی معرفی کنيد. چگونه به رشته بيوانفورماتيک پزشکي علاقه مند شديد؟
مهدي شاه حسيني هستم. زماني که دانشجوي مقطع ليسانس مهندسي برق- الکترونيک بودم، دستگاهي با عنوان غذادهي به حيوانات خانگي به صورت کاملا الکترونيکي ساختم. با توجه به علاقه‌اي که از دوران کودکي به پزشکي داشتم در سال 1395 در کنکور مقطع کارشناسي ارشد شرکت کردم و با رتبه 35 در رشته مهندسي پزشکي در دانشگاه علوم پزشکي اصفهان قبول شدم. وقتي وارد دانشکده علوم و فناوري‌های نوين پزشکي شدم با فيلدهاي مختلفي مانند پردازش سيگنال و تصاوير پزشکي، ساخت تجهيزات پزشکي، طراحي دارو و بيوانفورماتيک در طول مقطع ارشد نرم افزاري گرافيکي براي تحليل بخشي از مراحل آناليز ديتاي NGS طراحي و پياده سازي کردم و هم اکنون در حال تجاري سازي آن با حمايت مرکز فناوري‌هاي همگرا رياست جمهوري هستم.
داستان NGS Academy و فعاليت آموزشي شما در دنياي مجازي از کجا و چگونه شروع شد؟
در طي دوران مقطع ارشد به دليل جديد بودن موضوع پايان نامه و نبود کتاب رفرنس فارسي و دوره‌هاي آموزشي جامع در اين زمينه، مجبور شدم خودم شروع به مطالعه مقالات و کتاب‌هاي انگليسي رفرنس کنم. به دليل اينکه با مباحث پايهاي ژنتيک اصلا آشنايي نداشتم، خواندن کتاب‌ها و مقالات در ابتدا بسيار سخت و کند پيش مي‌رفت و اينجا بود که تصميم به تشکيل يک تيم گرفتم. با کمک يکي از دانشجويان ژنتيک پزشکي و يک متخصص برنامه نويسي توانستم ايده‌هايي که از اين کتاب‌ها و مقالات به دست آورده بودم را پياده سازي کنم. از آنجا که مهارت‌هاي فن بيان و تدريس خوبي هم دارم تصميم گرفتم در کنار کارهاي آناليز، تجربيات خود را در اين زمينه به دوستان آموزش دهم. بنابراين سايت و پيج اينستاگرام خود را راه اندازي کردم و هر هفته ويدئوهاي آموزشي و موقعيت‌هاي شغلي اين حوزه رو به دوستان معرفي مي‌کنم.
با توجه به دستاوردي که در حوزه نسل نوين توالي‌يابي يا Next–Generation Sequencing داشتيد لطفا کمي ما را با اصول کار اين دستگاه و بازار کار آن براي مهندسان پزشکي آشنا کنيد.
اگر بخواهم درباره دستگاه NGS و ورودي و خروجي آن صحبت کنم مي‌توانم به طور بسيار ساده بگويم که ورودي دستگاه،DNA استخراج شده از بافت يا خون است که براي شرکت ارائه دهنده خدمات توالي‌يابي NGS فرستاده مي‌شود. شرکت بعد از توالي‌يابي اين نمونه ارسالي، خروجي با فرمتFASTQ ايجاد مي‌کند. اين فايل بسته به نوع توالي‌يابي (توالي‌يابي کل ژنوم، پنل‌هاي ژني، توالي‌يابي کل اگزوم) انجام گرفته، ترتيب قرار گرفتن نوکلئوتيدها درDNA فرد را نشان مي‌دهد (شکل 1).
شکل 1-الف) ساختارDNA در بدن انسان ب) خروجي بعد از دستگاه توالي‌يابي
تکنولوژي نسل نوين توالي‌يابي (NGS) به کاربر اين اجازه را مي‌دهد که در يک آزمايش، DNA اي با سايز بيشتر از يک ميليون جفت باز را توالي‌يابي کند. اهميت NGS از ديد باليني اين است که مي‌تواند صدها، هزاران يا کل ژنوم را در يک مرحله توالي‌يابي کند. يکي از ويژگي‌هاي اصلي NGS پربازده بودن (High-Throughput) آن است. با توالي‌يابي موازي ميليون‌ها خوانش از طريق کوچک‌سازي حجم هر واکنش توالي‌يابي به دست مي‌آيد و موجب کاهش هزينه مواد مصرفي مي‌شود. در بعضي از پلتفرم‌هاي NGS (مانند نسل سوم) کوچک سازي به حدي رسيده است که مي‌تواند تنها يک مولکول DNA را توالي‌يابي کند.
يکي از فرصت‌هاي شغلي براي دوستان مهندسي پزشکي در اين زمان يادگيري اصول کار دستگاه و نحوه نگهداري آن است (شکل 2).
دستگاه NGS در ايران وجود دارد؟
بله. تعداد محدودي دستگاه توالي‌يابي وجود دارد ولي قابليت توالي‌يابي کل ژنوم يا اگزوم را ندارند. اميدوارم که اين دستگاه‌ها در سال‌هاي آينده با رفع تحريم‌ها وارد کشور شده و فرصت‌هاي شغلي مناسبي براي همکاران مهندس پزشک فراهم شود. البته کار مهندس پزشک تنها به تعمير و نگهداري اين دستگاه ختم نمي‌شود، بلکه اين شايد شروع کار است. اين دوستان مي‌توانند در زمينه آناليز اين ديتاها نيز فعاليت کنند. طي بررسي‌هاي که درباره اين سمت شغلي درآگهي‌هاي استخدامي خارج از کشور انجام دادم، حقوق ساليانه پيشنهادي براي اين افرادِ آناليزر حدود 60 هزار دلار است.
دست يافتن به اين فرصت شغلي با محدوديت روبرو است؟ اکنون چند درصد از شرکت‌ها و آزمايشگاه‌هاي داخل کشور اين دستگاه را دارند و در سمت آناليزر NGS نيرو استخدام مي‌کنند؟
محدوديت اصلي در اين حوزه کاري عدم وجود آناليزر حرفه‌اي و مسلط است. اغلب دوستاني که در رشته‌هاي ژنتيک فعاليت مي‌کنند توانايي کدنويسي، اسکريپت نويسي و کارکردن با سيستم عامل لينوکس را ندارند. از طرف ديگر دوستاني که در حوزه مهندسي پزشکي فعاليت مي‌کنند، درک درستي از مکانيسم بيماري‌هاي ژنتيکي ندارند. همين دلايل باعث شده است که افراد مسلط به آناليز کم باشند. اگر بخواهيم در مورد دستگاه صحبت کنيم، طبق بررسي‌هايي که انجام داده‌ام دستگاه توالي‌يابي که بتواند کل ژنوم انسان را توالي‌يابي کند نداريم و اغلب دستگاه‌هاي موجود در کشور از نوعNIPT هستند. اگر تحريم‌ها از بين برود حتما دوستان علاقه مند به تعميرات و نگهداري تجهيزات پزشکي مي‌توانند فرصت‌هاي شغلي خوبي داشته باشند. درحال حاضر بيشتر کار توالي‌يابي در خارج از کشور انجام مي‌شود ولي آزمايشگاه‌هايي که آناليزر دارند ترجيح مي‌دهند آناليزها را خودشان انجام بدهند.
افراد در اين سمت شغلي چه توانمندي‌هايي بايد داشته باشند؟
آشنايي و تسلط کافي به لينوکس، زبان‌هاي برنامه نويسي مثل پايتون و بش اسکريپت (Batch Scripting) تجربه کار کردن باAPI و سرويس‌هايCloud از جمله مهارت‌هاي مورد نياز است. همچنين از مهمترين ويژگي‌هايي که اين افراد بايد داشته باشند، داشتن دانش نسبي در مباحث پايهاي ژنتيک است. بهتر است که افراد آناليزر، يک زمينه تخصصي ژنتيک مانند سرطان، بيماري‌هاي نقص ايمني، فارماکوژنوميک، بيماري‌هاي خوني، تست‌هاي پيش از تولد (NIPT)، غربالگري اختلالات نادر، بيماري‌هاي عصبي و غيره انتخاب کنند و به طور تخصصي در يک حوزه مشغول به فعاليت شوند.
کاربرد بيوانفورماتيک در نسل نوين توالي‌يابي چيست؟
توانايي جستجوي جهش در ژنوم انسان به منظور يافتن علت بيماري ژنتيکي به توانايي تکنولوژي مورد استفاده براي توالي‌يابي مولکول DNA بستگي دارد. در ابتدا اين کار بسيار سخت و پر زحمت بود اما امروزه با ظهور تکنولوژي‌هاي جديد، محدوديتي در رابطه با توالي‌يابي يک، چندين يا کل ژن‌هاي انساني وجود ندارد. در زمينه‌ي تکنولوژي NGS، دو محدوديت وجود دارد؛ 1- تفسير واريانت (تغيير ژنتيکي ايجاد شده در فرد بيمار نسبت به ژنوم مرجع)، به دليل اينکه مطالعات اندکي در رابطه با عملکرد واريانت‌هاي نادر وجود دارد شناسايي اينکه واريانت پيدا شده واقعاً جهش ايجاد کننده بيماري است يا خير چالش برانگيز است 2- اين تکنيک‌ها قادر به شناسايي همه انواع واريانت‌هاي موجود در ژنوم مانند جهش‌هاي ساختاري نيستند.
آناليز ديتاي NGS چگونه صورت مي‌گيرد؟
صرف نظر از پلت‌فرم مورد استفاده، داده‌هاي توليد شده توسط تکنولوژيNGS در سه مرحله اصلي آناليز مي‌شوند. هر کدام از مراحل شامل چندين گام است که در شکل 3 قابل مشاهده است. تاکنون بيش از 300 ابزار مختلف به منظور ارزيابي کيفيت، همترازي، فراخواني واريانت‌ها و حاشيه نويسي Annotation)) داده‌هايNGS توسعه يافته است. ترکيب ابزارهاي مختلف به منظور تحليل داده‌هاي توليد شده در هر مرحله به عنوان پايپ لاين بيوانفورماتيکي شناخته مي‌شود. انتخاب مجموعه مناسبي از اين ابزارها با توجه به نوع بيماري که مي‌تواند يک بيماري تک ژني، چند ژني يا سرطان باشد مهمترين چالش در ارتباط با مديريت و آناليز داده‌هاي NGS است.
مرحله اوليه آناليز ديتاها توسط شرکت خدمات دهنده NGS انجام مي‌شود. مرحله دوم و سوم توسط يک مهندس پزشک با مهارت‌هايي که در بالا ذکر شد قابل انجام است. در مرحله سوم آناليز داده‌هايNGS از محصول گام دوم، فايل VCF استفاده مي‌شود و به منظور شناسايي واريانت‌هايي که به طور معناداري با بيماري فرد در ارتباط هستند الويت‌بندي، طبقه‌بندي و فيلترينگ انجام مي‌شود. در اين مرحله با استفاده از پايگاه‌هاي داده و الگوريتم‌هاي مختلف، يک سري اطلاعات يا اصطلاحاً حاشيه نويسي به هر واريانت نسبت داده مي‌شود که در مراحل بعدي با استفاده از اين اطلاعات واريانت‌ها را اولويت‌بندي و فيلتر مي‌کنيم. هدف از انجام مرحله سوم آناليز داده‌هاي NGS، تشخيص واريانت‌هاي بيماري‌زا از واريانت‌هاي خنثي و خطاهاي توالي‌يابي است.
آناليز داده‌هاي نسل نوين توالي‌يابي شامل 3 مرحله است. در مرحله اول دستگاه توالي‌يابي مجموعه‌اي از خوانش‌ها را همراه با نمرات کيفي آن‌ها در قالب يک فايل FASTQ ايجاد مي‌کند. در مرحله دوم پس از انجام فرآيند کنترل کيفيت و حذف خوانش‌هاي با کيفيت پايين، خوانش‌ها با ژنوم رفرنس مقايسه مي‌شوند که منجر به شناسايي واريانت‌ها مي‌شود. آناليز مرحله اول و دوم عموماً به طور خودکار انجام مي‌شود. آناليز مرحله سوم شامل Annotation و فيلترينگ واريانت‌ها به منظور يافتن آن دسته از واريانت‌هايي است که با مرتبط با فنوتيپ فرد است و داراي اهميت باليني است.
چگونه مي توان از NGS در مقابله با اپيدمي ويروس کرونا استفاده کرد و چه بينشي را مي‌تواند در اختيار محققان قرار دهد؟
در دسامبر 2019، يک سندرم حاد تنفسي شديد(SARS) از ويروس کرونا (SARS-CoV-2) در شهر ووهان چين شناسايي شد و به سرعت به يک پاندمي تبديل شد. طبق آمار سازمان بهداشت جهاني (WHO) در حال حاضر تعداد موارد مبتلا از مرز 100 ميليون نفر و مرگ ومير ناشي از آن نيز از مرز 2 ميليون نفر گذشته است. تنوعات ژنتيکي سال‌هاست که به منظور کشف مکانيسم ايجاد کننده بيماري‌ها مورد توجه قرار گرفته‌اند. اطلاعات فعلي در مورد نقش تنوعات ژنتيکي در تعيين ميزان عفونت SARS-CoV-2 در جمعيت‌هاي مختلف محدود است. تکنيک آزمايشگاهي qPCR در حال حاضر براي تشخيص ويروس کرونا استفاده مي‌شود اما اين تکنيک قادر به رمزگشايي از تغييرات ژنوم ويروسي نيست. علاوه بر اين، وجود بيماري‌هاي نقص ايمني اوليه در برخي افراد زمينه ساز عفونت‌هاي شديد ناشي از سندرم حاد تنفسي مي‌شود. تاکنون بيش از 400 ژن در ارتباط با بيماري‌هاي نقص ايمني اوليه به ثبت انجمن بين‌المللي ايمونولوژي (IUIS) رسيده است. درک تعاملات بين ژنوم ويروس و سيستم ايمني انسان براي کمک به شناسايي افراد در معرض خطر و در عين حال افزايش شانس ايجاد روش‌هاي درماني موثرتر و واکسن، امري حياتي است. توانايي جستجوي جهش در ژنوم به منظور يافتن تنوعات ژنتيکي به توانايي تکنولوژي مورد استفاده براي توالي‌يابي مولکول DNA بستگي دارد. در ابتدا اين کار بسيار دشوار و پر زحمت بود اما امروزه با ظهور تکنولوژي NGS محدوديتي در رابطه با توالي‌يابي يک، چند يا کل ژن‌هاي انساني وجود ندارد. نسل نوين توالي‌يابي به عنوان تکنولوژي تعريف مي‌شود که امکان توالي‌يابي کل مولکول DNA با سايز بيش از يک ميليون جفت باز را در يک آزمايش فراهم مي‌کند.
دیدگاه ها